液相色譜柱作為液相系統(tǒng)的核心部件，也是我們日常分析中的關鍵組成部分，且價格相對昂貴。若能采用正確的方法使用和維護，就可以延長其使用有效期，在保障分析工作質量的同時有效節(jié)約成本。

1.反相柱

反相色譜柱常見鍵合相包括：C18（十八烷基）、C8（辛烷基）、C4（四碳鏈）、Phenyl（苯基）、PFP（五氟苯基硅膠）等。

1.1活化平衡

（1）在新色譜柱剛開始啟用時，從報告證書中獲取色譜柱出廠時的儲存溶劑等信息，使用與儲存溶劑相溶的流動相（如甲醇、甲醇水、乙腈、乙腈水等）活化色譜柱至少20倍柱體積，活化時的初始流速一般較低，推薦0.2~0.5ml/min。

（2）在進行分析之前，請使用合適比例的水相（例如：10%的甲醇水或者10%的乙腈水溶液）或不含鹽的流動相平衡柱子至少20倍柱體積，以使色譜柱達到平衡。

1.2使用或清洗

（1）使用完成后，用至少20倍柱體積的高比例水相（含有≥50%水的極性有機溶劑，如10%的甲醇水或者10%的乙腈水溶液）作為流動相以除去柱子中的緩沖鹽。若流動相中不含緩沖鹽，可取消此步驟。

（2）使用至少20倍柱體積的含有高比例有機相（含有≥80%有機溶劑，如80%的甲醇水或者80%的乙腈水溶液）清洗柱子。

（3）污染物的去除：常規(guī)清洗后柱效沒有明顯恢復時，可以使用50%異丙醇/乙腈溶液以低流速（不要超過色譜柱的最大耐受壓力）清洗至少20倍的柱體積以去除污染物。

1.3 保存

清洗完成后，推薦將反相色譜柱保存在高比例的有機相中，如有機相（甲醇/乙腈）-水=80:20

1.4 使用注意事項

（1）不能超出色譜柱耐受的pH使用。

（2）使用時，色譜柱的溫度不能超過說明書的使用范圍，一般是60℃。

（3）使用前，需要觀察流動相的狀態(tài)，不能使用長菌的流動相，流動相使用前需過濾。

（4）如果流動相有超過95%的水相，推薦使用耐水的鍵合相，保證進樣重復性。

2. HILIC色譜柱

常見的HILIC色譜柱有：純硅膠柱、氨基柱（用于HILIC模式）、二醇基柱、酰胺基柱等

2.1活化平衡

（1）使用50倍柱體積的50/50的乙腈/水相緩沖溶液（緩沖液的最終濃度為10mM，如甲酸銨、乙酸銨等）平衡新色譜柱。（需提前查閱說明書，若溶劑不相容，需要提前采用合適的溶劑過渡。）

（2）在開始進樣前，用20倍柱體積的起始流動相平衡色譜柱。

2.2 清洗和再生

當使用過程中，色譜柱的壓力驟然升高，保留時間或分離度改變時，往往表明色譜柱被污染了?？捎?0/50的乙腈/水清洗以去除極性污染物。如果清洗無效，可用更低比例的乙腈/水（40:60）清洗色譜柱。如果色譜柱壓力過高或色譜峰分叉，通常代表需要更換新色譜柱。

2.3 保存

（1）如果短時間內不使用色譜柱，可以將其將其保存在與流動相組成相同的有機溶劑和水的混合溶液（不含酸、無機鹽）中。

（2）較長時間內不使用色譜柱（超過四天），請將柱子保存在95％乙腈中；如果流動相中含有緩沖鹽，先用與流動相組成相同的有機溶劑和水的混合溶液（不含酸、無機鹽）沖洗色譜柱10倍柱體積，然后換上95％乙腈保存。

2.4 注意事項

（1）流動相中水相的比例不能低于3%，一般保持5％的極性溶劑（如5％水相緩沖液，5％甲醇或3％甲醇+2%水相緩沖液等），保證HILIC硅膠填料始終被水浸潤。

（2）在流動相或梯度中至少保持有機溶劑（如乙腈）的比例不低于40％

（3）因為磷酸鹽在高比例有機相中易析出，不推薦使用磷酸鹽體系，但可以使用磷酸。

（4）甲酸銨或乙酸銨水溶液緩沖系統(tǒng)比甲酸或乙酸的水溶液重現(xiàn)性更好。如果不能使用緩沖液而一定要使用流動相添加劑如甲酸，最好使用0.2%的濃度而非0.1%。

（5）為得到最好的峰形，在流動相或梯度中總是保持緩沖系統(tǒng)的濃度為10mM。

（6）如果可能，盡量用100％乙腈溶解樣品進樣。避免使用水配制樣品溶液。最常用的進樣溶劑為75/25 乙腈/甲醇。

（7）不要用水或DMSO做稀釋劑，它們將導致峰形變得很差

（8）請確保洗針溶劑/沖洗溶劑包含和流動相一樣的高比例有機相，否則峰形會受到影響。

（9）進行梯度分析時，進樣間隔需要用10倍柱體積起始流動相平衡色譜柱，色譜柱平衡不充分將導致保留時間漂移。

3. 正相色譜柱

常見的正相色譜柱有：氨基柱（正相模式）、硅膠柱等。

3.1 活化平衡

（1）首先需要確認保存溶劑，正相色譜柱通常都保存在正己烷等非極性溶劑中。使用前需檢查柱內保存溶劑與目標流動相的相溶性，若不能互溶，需要使用過渡溶劑（如乙酸乙酯、二氯甲烷等）逐步進行轉換。

（2）新柱使用前需用流動相平衡20-30個柱體積，以去除保存溶劑并使填料達到穩(wěn)定狀態(tài)。

3.2 清洗和再生

（1）清洗：實驗結束后，用流動相沖洗色譜柱10-20個柱體積，去除殘留樣品和雜質。若使用含鹽流動相，需先用不會鹽的流動相沖洗足夠的體積，再用有機溶劑沖洗。

（2）再生處理：若柱效下降，可嘗試用正己烷→氯仿→二氯甲烷→異丙醇→正己烷的順序反向沖洗，每次20個柱體積，以去除吸附雜質。

3.3 保存

短期保存（隔夜或周末）可使用當前流動相保存；長期保存需用正己烷或異丙醇等非極性溶劑，避免柱床干燥或固定相水解。

3.4 使用注意事項

（1）初始流速宜低（如0.2ml/min），待柱壓穩(wěn)定后再逐步增加至目標流速，避免壓力突變損傷填料。

（2）正相色譜一般不使用緩沖鹽，若需使用，需嚴格控制濃度和pH，并在實驗后徹底沖洗。

（3）需要適配合適的正相系統(tǒng)（如流動相管路等）。

4. 離子色譜柱

例如Thermo的BioBasic AX,SCX,Hypersil SAX,Hypersil Gold AX SAX等系列色譜柱。

4.1 色譜柱活化

（1）新柱在使用前，請預先用20倍柱體積甲醇/或乙腈沖洗色譜柱，然后以初始流動相（不含鹽）沖洗10倍柱體積。

（2）在進行正式分析之前，請使用至少20倍柱體積的流動相沖洗色譜柱，以使色譜柱達到平衡。

4.2 清洗和再生

（1）常規(guī)清洗：每天完成分析之后，用100%水沖洗30 倍柱體積除鹽，然后用20%甲醇/或乙腈沖洗20個柱體積，保存在20%甲醇/或乙腈中。

（2）清洗強保留污染物：如果發(fā)現(xiàn)離子交換色譜柱柱效出現(xiàn)大幅下降，可通過如下方法清洗離子交換色譜柱：首先用高濃度的緩沖鹽溶液清洗（濃度是流動相的5-10倍，但不得超過1M），沖洗30倍柱體積。用100%水沖洗20倍柱體積以除鹽后，再用100%甲醇/或乙腈清洗30倍柱體積。最后用20%甲醇/或乙腈水溶液（不含鹽）保存。

4.3 保存

用100%水沖洗30倍柱體積除鹽后，若短期不使用（<1周），用20%甲醇/或乙腈沖洗20倍柱體積后，保存在20% 甲醇/或乙腈中；若需長期放置（>1周），用50%甲醇/或乙腈沖洗20倍柱體積后，保存在50%甲醇/或乙腈中。

4.4 注意事項

（1）流動相中使用使用高純度試劑（優(yōu)級純或色譜純）配制淋洗液，使用電阻率≥18.2MΩ·cm的超純水。

（2）離子色譜柱使用是最后搭配保護柱使用。

目前色譜柱的種類繁多，除了上述提到的類型外，還有例如凝膠色譜柱、GPC分析用色譜柱、雙重混合模式色譜柱等，對于不同的色譜柱，其使用、維護和保存都有其特殊要求，在日常使用中，我們應注重其使用說明書的相關要求，用正確的方法使用，在保障效率的同時最大程度的節(jié)約成本。

本文由廣州佳譽醫(yī)療器械有限公司/佛山浩揚醫(yī)療器械有限公司聯(lián)合編輯