一、細胞毒性

細胞毒性試驗是利用細胞培養(yǎng)技術，確定由器械、材料和（或）其浸提液引起的細胞溶解（細胞死亡），細胞生長抑制，克隆形成和其他細胞方面的影響。常根據(jù)ISO 10993-5/GB/T 16886.5進行測試。

醫(yī)療器械細胞毒性試驗憑借其操作簡便、周期短、靈敏度高、性價比高等特點，成為了最常用的生物相容性測試之一，常用于評價醫(yī)療器械中是否含有可能危害人體健康的物質存在。

醫(yī)療器械細胞毒性試驗的特點及解決方案

 

二、細胞毒性試驗的特點及解決方案

隨著這些年醫(yī)療器械的大力發(fā)展，特別是創(chuàng)新類材料器械的不斷涌現(xiàn)，在國產(chǎn)器械加速替代的同時，也越來越多的出現(xiàn)細胞毒性測試不合格的情況。遇到這些情況，建議可以從以下幾方面著手：

1. 體外細胞毒性本身的局限性

需特別指出的是：

體外細胞毒性不合格結果≠體內毒性反應≠生物相容性毒性反應

體外數(shù)據(jù)統(tǒng)計學意義≠毒理學意義≠生物學意義

ISO 10993-5明確指出：“任何細胞毒性反應可能都是重要的。但是，這主要預示潛在的體內毒性，僅根據(jù)細胞毒性數(shù)據(jù)不一定能確定該器械不適合給定的臨床應用。”因此，如果在體外細胞毒性試驗中觀察到細胞毒性反應，應如何確定醫(yī)療器械的實際臨床風險？例如，臨床實踐中，某些可溶性金屬離子（如Cu、Ni等）在體外顯示細胞毒性，但是在植入器械臨床應用中卻表現(xiàn)出良好的臨床耐受性，在長年的臨床實踐中并未在人體中顯示出毒性反應。再比如，在細胞毒性的標準試驗中，很多檢測機構都選擇有注冊證的乳膠手套作為細胞毒性的陽性對照，而這些陽性物質都是準允上市的產(chǎn)品。

這些現(xiàn)象一方面源于人體復雜的防御和修復機制，包括體內代謝途徑的解毒作用及局部微環(huán)境的緩沖能力等；另一方面也與檢測方法的高靈敏度的特點有關。人體是一個高度復雜且精密調控的有機系統(tǒng)，具有獨特的生理耐受性和自我修復機制，再加上體外測試的高度靈敏度，促使了很多人體“無毒性”而體外細胞“中毒”的現(xiàn)象存在。當然，這一現(xiàn)象也被審評考慮在內，經(jīng)驗表明，面對部分細胞毒性陽性結果的器械，只要能提供證據(jù)證明產(chǎn)品的臨床可接受性，審評也是可以接受的。

對于上述原因導致的細胞毒不合格，建議建立科學的毒理學風險評估框架：

開展化學表征（可提取物/可浸出物分析）

進行同類上市產(chǎn)品的比對分析

補充體內試驗（如豚鼠致敏試驗、家兔刺激試驗、全身毒性試驗）

文獻數(shù)據(jù)支持（已有的臨床使用史證明）

比如對于一些含有抑菌作用的避孕套，因含有對細胞的生長和繁殖不利影響的物質，導致細胞毒性不過；那么這個時候，可以通過相同上市產(chǎn)品的比較/體內豚鼠致敏試驗/家兔陰道刺激/化學表征評價的方法來說明產(chǎn)品的臨床可接收性。

2. 不同測試方法的適用性

醫(yī)療器械細胞毒性試驗的特點及解決方案

FDA更推薦用MEM洗脫法進行試驗，國內/歐洲更推薦用MTT定量試驗。下表簡單列舉三種方法進行比較：

測試方法

MEM洗脫法

MTT比色法

瓊脂擴散法

簡介

定性

將小鼠成纖維細胞系L929暴露在受控環(huán)境中制得的器械提取物中，并在顯微鏡下檢查細胞的整體細胞數(shù)量和活力，重點關注細胞形狀和細胞質結構，根據(jù)標準給予評分

定量

一種非主觀的吸光度定量測量。從活細胞產(chǎn)生的有色溶液中，活細胞數(shù)量的增加或整體代謝活性增加導致顏色強度的增加；將細胞活性轉化為溶液的顏色深度

定性

位于細胞上層的瓊脂層充當屏障，模仿表皮頂層（角質層）的功能

接受標準*

分級＞2級時被認為有細胞毒性作用（0~4）

細胞活性下降＞30%被認為有細胞毒性作用

分級＞2級時被認為有細胞毒性作用（0~4）

優(yōu)點

細胞結構的可視化、細胞形態(tài)的觀察和細胞內結構的觀察可以提供額外的信息

標準化設備儀器，減少人為偏差，形成劑量-反應曲線；

提供定量數(shù)值與毒理學數(shù)據(jù)比較

模擬人體皮膚，適用于僅與完整皮膚接觸的器械；細胞形態(tài)的可視化

缺點

由于細胞活力分析使用人工顯微鏡可視化，主觀性強，結果的準確性具有潛在的偏差，嚴重依賴于評估者的經(jīng)驗水平

不能提供關于細胞形狀、細胞內結構和其他特性的額外信息，這些信息將有助于確定試驗品提取物所施加的毒性水平和類型；

對于有顏色器械浸提液，不能排除受試物顏色干擾

來自細胞形態(tài)觀察者的潛在偏差；需要評估員具備一定水平的專業(yè)知識

*：參考16886/10993標準

不合適的測試方法可能會導致細胞毒性測試結果不準確；要根據(jù)不同的產(chǎn)品特性和不同監(jiān)管的要求，選擇適合自己的測試方法。如：一種帶顏色的生物墨水，其細胞毒測試結果不合格，但文獻資料顯示該材料無細胞毒性，后來發(fā)現(xiàn)選用的測試方法是MTT比色法。MTT比色法是將細胞的代謝產(chǎn)物染成藍色，通過溶液的顏色判斷細胞的活性水平。那么，浸提液本身帶顏色的醫(yī)療器械就很容易影響到測試結果，故此類器械選擇MTT比色法可能不合適。類似的還有

接觸鏡類產(chǎn)品，可采用瓊脂擴散法（YY/T 0719.7-2011眼科光學　接觸鏡護理產(chǎn)品　第7部分：生物學評價試驗方法），

口腔類也推薦擴散法（口腔醫(yī)療器械生物學評價第2單元：試驗方法細胞毒性試驗：瓊脂擴散法及濾膜擴散法）。

這里需要額外說明，雖然瓊脂擴散法允許直接測試特定器械，但一些浸出物可能無法通過瓊脂層擴散或可能與瓊脂發(fā)生反應，此時測試結果可能不夠準確。因此，監(jiān)管機構會對瓊脂擴散法的測試結果較為關注，通常會要求檢測機構提供證明此方法的適用性。

方法選擇建議：

a) 有色浸提液的樣品避免使用MTT法（如案例中的藍黑色生物墨水）

b) 接觸鏡類產(chǎn)品優(yōu)先選用瓊脂擴散法

c) 需考慮監(jiān)管要求差異（FDA傾向MEM浸提液法，國內/歐盟推薦MTT法）

3. 測試過程的注意事項

浸提

大部分的醫(yī)療器械樣品是通過浸提的方式，將獲得的樣品浸提液與細胞接觸從而測試器械的細胞毒性。簡單講，就是將醫(yī)療器械泡在浸提介質中，將醫(yī)療器械的毒性成分轉移到浸提液中；類似于“燉雞湯”的過程，“雞”類比“醫(yī)療器械”，“雞湯”類比“浸提液”。那么，如何燉出一鍋“好雞湯”？

燉雞湯

器械浸提

標準要求

自來水？山泉水？

浸提介質種類

含血清培養(yǎng)基/生理鹽水溶液/其他適宜的介質

整雞？切成小塊？

器械是否要切割

除非不適用性，應將材料切成小塊，以使材料浸沒在浸提介質中

雞和水的比例

浸提比例

6（3）cm2：1 mL

0.2（0.1）g：1 mL

燉湯溫度和時間

浸提溫度

37℃,24 h / 37℃,72 h / 50℃,72 h /

70℃,24 h / 121℃,1 h

是否攪拌

動態(tài)浸提

宜在攪動或循環(huán)的條件下進行

標準的出發(fā)點傾向于確保絕對安全，但加嚴對于特定的器械，可能不適用。

浸提介質種類

不同浸提介質可能會影響醫(yī)療器械釋放出的物質種類和數(shù)量，從而影響細胞毒性結果。

廣東佛山中心血站-官亞妹探討三種浸提介質對一次性使用血液灌流器體外細胞毒性評價的影響，發(fā)現(xiàn)不同浸提介質對血液灌流器細胞毒性的影響不同。其中，0.9%氯化鈉浸提時的相對存活率最高，培養(yǎng)基次之，含血清培養(yǎng)基浸提時的相對存活率最低。這可能是因為用0.9%氯化鈉浸提時，血液灌流器釋放出的物質較少，對細胞的損傷較??；而含血清培養(yǎng)基浸提時，血液灌流器釋放出的物質較多，對細胞的損傷較大。從而得出結論：不同浸提介質對一次性使用血液灌流器體外細胞毒性評價有顯著影響，應根據(jù)實際應用場景選擇合適的浸提介質進行評價，為該類醫(yī)療器械的生物相容性評價提供了參考。

廣東醫(yī)療器械所也有過相關報道；一般來說，對于很多種類的醫(yī)療器械產(chǎn)品采用含血清的培養(yǎng)基進行浸提即可達到實驗所需，但對于一些含有吸附作用的產(chǎn)品如含活性炭和樹脂的血液灌流器，他們在用含血清培養(yǎng)基浸提時，能夠吸附血清蛋白等其他一些未知的營養(yǎng)成分。所以對于一些有吸附作用的醫(yī)療器械產(chǎn)品，應該考慮在用含血清培養(yǎng)基作為浸提介質時，是否會因醫(yī)療器械的吸附特性導致浸提液中維持細胞生長的營養(yǎng)成分的不足，從而導致細胞狀態(tài)不好，細胞毒性增加的假陽性結果。

另一個例子是用于沖洗手術部位的沖洗管。這些管通常由PVC制造，在用標準優(yōu)先推薦的細胞毒性測試系統(tǒng)：含血清培養(yǎng)基（極性+非極性）進行浸提，可能會產(chǎn)生細胞毒性反應。在這種情況下，如果可以證明與設備一起使用的沖洗液只有極性，并且預計不會與患者有其他接觸，則可以調整細胞毒性研究方法，僅考慮極性浸提條件，以證明臨床相關條件是否對測試結果有影響。

器械是否要切割

通常，對于細胞毒性測試，需要樣品切割成小塊以使材料浸沒在浸提介質中。但有些樣品，切割可能會暴露原先沒有暴露的表面（如內腔或切面），可能在測試系統(tǒng)中產(chǎn)生夸張的反應，導致細胞毒性不過。例如：彈性體、涂層材料、復合材料、多層材料等，由于完整表面與切割表面存在潛在的浸提性能差異，如能證明臨床不可能接觸內表面，應盡量完整地進行浸提。

滅菌方式

醫(yī)療器械常用的滅菌方式主要有環(huán)氧乙烷EO滅菌、高壓蒸汽滅菌和紫外滅菌。

EO滅菌：對細胞生長產(chǎn)生毒性作用，需注意EO滅菌后的解析殘留。

高壓蒸汽滅菌：121℃，需考慮產(chǎn)品的耐受性。

紫外滅菌：物理滅菌方式，經(jīng)濟簡便，光線滅菌，只適用于光能照到的表面滅菌。

安徽省食藥檢葉小惠探討了不同滅菌方式對4種醫(yī)療器械或材料細胞毒性評價結果的影響，結果如圖

醫(yī)療器械/滅菌方式

紫外輻照滅菌UV

高壓蒸汽滅菌HT

環(huán)氧乙烷滅菌EO

一次性使用醫(yī)用口罩

87%

85%

90%

手術解剖器(鑷體)

87%

90%

98%

橡膠塞

85%

88%

91%

一次性使用輸液器

90%

76%

67%

備注：存活率（小于70%，考慮其具有細胞毒性）

一次性使用輸液器的聚氯乙烯(PVC)管路部分經(jīng)UV滅菌、HT滅菌和EO滅菌后的浸提液法結果分別為1級、1級和2級，MTT法結果表明在UV滅菌和HT滅菌方式下細胞存活率均>70%，EO滅菌條件下細胞存活率<70%,具有潛在的細胞毒性作用,分析考慮可能EO滅菌方式下輸液器浸提液中存在某種溶出物或其所含成分的濃度具有潛在的細胞毒性反應，而在UV滅菌和HT滅菌條件下可能破環(huán)了其成分，影響浸提液溶出物的釋放，從而導致檢測結果發(fā)生變化。一次性使用輸液器一般適用UV滅菌和HT滅菌條件，常規(guī)選擇EO滅菌方式。PVC軟管在一些非無菌產(chǎn)品中可能也涉及,進行生物學評價時送檢樣品屬于非無菌產(chǎn)品，由于細胞毒性試驗要求樣品屬于無菌產(chǎn)品,企業(yè)在送檢時可能會選擇HT滅菌從而造成假陰性的試驗結果。

4. 測試環(huán)節(jié)引入的問題

這一部分主要和檢測實驗室相關，細胞毒性測試畢竟是一個無菌生物試驗，潔凈室的等級/平板接種細胞的均勻程度/染毒量的精確度/人員熟練度/操作規(guī)范性等都會影響細胞毒性結果。因此，在進行MTT細胞毒性時可以通過空白孔的偏差/同一濃度梯度孔的偏差/50%與100%觀察數(shù)據(jù)的趨勢性/鏡下細胞形態(tài)/MTT定量數(shù)據(jù)吻合度來判斷。

醫(yī)療器械細胞毒性試驗的特點及解決方案

5. 產(chǎn)品本身的原因

導管類材料

河南省醫(yī)療器械所通過對隨機抽取8家生產(chǎn)企業(yè)的10批次涂層導尿管進行測試，發(fā)現(xiàn)PVC基材的涂層導管體外細胞毒性小，生物相容性高；乳膠基材的涂層導尿管，細胞毒性結果有差異。

醫(yī)療器械細胞毒性試驗的特點及解決方案

江西省醫(yī)療器械所通過對4種導管材質[聚氯乙烯（PVC）（增塑劑DEHP）、PVC（增塑劑TOTM）、熱塑性聚氨酯彈性體（TPU）、聚烯烴熱塑性彈性體（TPE）]的輸液器樣品檢測發(fā)現(xiàn)：一次性使用輸液器細胞毒性來源為輸液器導管部分；相較PVC及TPU，TPE材質導管具有相對較低的細胞毒性；且灌注法相對常規(guī)克重法更適合一次性使用輸液器細胞毒性評價。

塑料中有毒物質的潛在來源：增塑劑

市場上許多醫(yī)療器械是用塑料材料制造的（例如，血袋、管套、注射器），增塑劑（例如，鄰苯二甲酸鹽，雙酚A）被添加到塑料材料中以增加柔韌性和彈性。醫(yī)療器械行業(yè)中使用的增塑劑多為鄰苯二甲酸酯，包括鄰苯二甲酸雙（2-乙基己基）酯（DEHP）。

DEHP及其代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（MEHP）與人體內分泌紊亂有關。增塑劑不通過共價鍵而是更松散地嵌入塑料樹脂基體中，因此，它們更容易被釋放，并通過直接和/或間接方式與人體接觸。常見的直接接觸包括口腔和皮膚接觸（例如，通過放置在口腔內或皮膚上的裝置），間接接觸是通過吸入或暴露于接觸過含DEHP材料的液體（如血液、呼吸）。每種增塑劑從材料中遷移的速率取決于增塑劑和嵌入樹脂的特性。增塑劑一旦進入體內，就會被水解成代謝物。初級代謝物因特定增塑劑而異；然而，最常見的MEHP，對苯二甲酸乙二醇酯，鄰苯二甲酸乙二醇酯和鄰苯二甲酸乙二醇酯，對L929小鼠細胞的細胞毒性比母體增塑劑（DEHP， DINP和DINCH）更大。當大量吸入塑化劑時，可能會產(chǎn)生毒性作用，影響呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等。因此，這類原材料的器械需特別注意。

脫離劑量談毒效應，都是耍流氓

“毒性并不是有毒物質持有的屬性，而是所有物質的一般屬性”。“萬物皆有毒，劑量決定一切”。食鹽是我們日常生活中不可或缺的物質，但是隨著攝入人體的食鹽劑量的增加，它的“毒性”也會慢慢體現(xiàn)出來。器械產(chǎn)品也是如此；許多產(chǎn)品喜歡添加金屬，但最終使用者接觸到的金屬/化合物的具體量，決定了金屬/化合物在整個生物體水平上是否有毒。還應注意的是，特定的表面處理，如鈍化和陽極化，可影響醫(yī)療器械中金屬離子的釋放，從而改變其潛在的毒理學效應。因此，對于一些潛在毒性大的原材料，可能需要對器械的表面進行保護處理，確保其無法析出或析出的量少，從而能在人體的耐受范圍內。

 

三、結論

盡管常見的細胞毒性試驗，如MEM洗脫試驗或MTT試驗，可以預估體外細胞毒性，但體外跟體內條件相差很大，體外預估結果可能高估了體內潛在的不良反應，并不總是對應于準確/有效的臨床反應。在這些情況下，結合分析化學方法（如化學表征可提取/可浸出測試），科學/政府機構（如ATSDR、IRIS、ECHA）現(xiàn)有的系統(tǒng)毒性數(shù)據(jù)和已發(fā)表的同行評議的科學文章，可為評估患者的毒理學風險和臨床安全性提供參考框架。另外，對最終成品醫(yī)療器械進行輔助動物試驗可有助于研究體外細胞毒性陽性的臨床影響，特別是不與最終用戶和患者長期接觸的器械。

 

四、參考文獻

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7.AAMI/ISO 10993-5:2009/(R)2014. Biological evaluation of medical devices—Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Arlington, VA: Association for the Advancement of Medical Instrumentation.

 

 

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